熒光定量PCR分析儀通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化，結(jié)合Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，實(shí)現(xiàn)基因的精準(zhǔn)定量，其核心原理與實(shí)現(xiàn)步驟如下：

　　核心原理

　　在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)（如SYBRGreen染料或TaqMan探針），使熒光信號(hào)強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物量同步變化。每完成一個(gè)PCR循環(huán)，儀器采集一次熒光信號(hào)，生成擴(kuò)增曲線。通過(guò)設(shè)定熒光閾值（通常為基線信號(hào)的10倍標(biāo)準(zhǔn)差），確定擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（Ct值）。Ct值與起始模板量呈負(fù)相關(guān)，即起始模板量越多，Ct值越小。

　　實(shí)現(xiàn)步驟

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建：使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（如純化質(zhì)粒DNA或體外轉(zhuǎn)錄RNA）進(jìn)行梯度稀釋，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍在10²-10¹?拷貝數(shù)時(shí)，模板濃度與Ct值通常呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R²>0.99），確保在此范圍內(nèi)可準(zhǔn)確定量。

　　未知樣本檢測(cè)：將未知樣本與標(biāo)準(zhǔn)品同步擴(kuò)增，根據(jù)其Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算樣本中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。例如，若標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=3.1372x+38.201（y為Ct值，x為拷貝數(shù)對(duì)數(shù)），通過(guò)反向計(jì)算即可得出樣本的初始模板量。

　　內(nèi)參基因校正（相對(duì)定量）：在需要比較不同樣本間基因表達(dá)差異時(shí)，選擇管家基因（如GAPDH、β-actin）作為內(nèi)參，通過(guò)計(jì)算目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的Ct值差值（ΔCt），進(jìn)一步采用ΔΔCt法分析相對(duì)表達(dá)量，消除樣本量及反應(yīng)效率差異的影響。